Wykrywanie mutacji APC w kale DNA u pacjentów z guzami jelita grubego ad 6

Aby zwiększyć swoistość testu skracania białka cyfrowego i kontrolować błędy generowane przez polimerazę, uznaliśmy wynik testu za dodatni pod względem mutacji tylko wtedy, gdy skrócone białko o tej samej wielkości zostało zidentyfikowane co najmniej dwa razy spośród 144 reakcje przeprowadzone na każdej próbce. Analiza danych od pacjentów chorych na raka i kontrolnych
Ryc. 2. Ryc. 2. Przykłady wyników testu skracania białek cyfrowych u sześciu pacjentów z mutacjami obciętymi w APC. Produkt białkowy typu dzikiego wynosi 43 kD. Produkty transkrypcji i translacji in vitro z 30 pojedynczych reakcji (15 reakcji na panel) pokazano dla każdego pacjenta, a nieprawidłowe polipeptydy zaznaczono strzałkami. Ze względu na rozkład Poissona cząsteczek matrycowych, okazjonalna ścieżka nie zawiera szablonów i jest pusta (np. Ścieżka 2 próbki od Pacjenta 5).
Mutacje zidentyfikowano w 26 z 46 próbek kału od pacjentów z neoplazją (57%, przedział ufności 95%, 41 do 71%) z zastosowaniem testu skracania białka cyfrowego. Reprezentatywne pozytywne wyniki przedstawiono na rycinie 2. Średnia liczba nieprawidłowych reakcji u pacjentów z wynikiem dodatnim wynosiła 7,5 i wahała się od 2 do 39 (144 wszystkich reakcji przeprowadzonych u każdego pacjenta). Nie wykryto mutacji w teście skracania białka cyfrowego w kale od 28 pacjentów kontrolnych, którzy nie mieli choroby nowotworowej (0%, przedział ufności 95%, 0 do 12%, P <0,001). Pozytywne wyniki uzyskano u 17 z 28 pacjentów z rakiem Dukesa stadium B2 (61%, przedział ufności 95%, 41 do 79%) i 9 z 18 pacjentów z gruczolakami o średnicy co najmniej cm (50% ; 95-procentowy przedział ufności, od 26 do 74%). Ponadto u 20 z 36 pacjentów z nowotworami dystalnymi do zgięcia śledziony (56%, przedział ufności 95%, 38 do 72%) miało wyniki pozytywne, podobnie jak 6 z 10 pacjentów z bardziej proksymalnymi zmianami (60%, przedział ufności 95%). , 26 do 88 procent). W dodatnich próbkach kału od 0,4 do 14,1 procent wszystkich genów APC zawiera mutacje (tabela 1).
Potwierdzenie mutacji
Figura 3. Figura 3. Mutacje wytwarzające skrócone polipeptydy w teście skracania białek cyfrowych. Produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które wytworzyły nieprawidłowe polipeptydy w teście skracania białka cyfrowego, zastosowano do analizy sekwencji, jak opisano w rozdziale Metody. W każdym przypadku startery wybrano na podstawie pozycji mutacji oczekiwanej z wyników skracania białka cyfrowego. Dla każdego pacjenta górny chromatogram reprezentuje sekwencję typu dzikiego, a dolny chromatogram przedstawia sekwencję zmutowaną (strzałki wskazują miejsce zmiany genetycznej). Przedstawiono także autoradiogramy żeli do sekwencjonowania z produktów PCR pochodzących z próbek nowotworów od czterech pacjentów; groty strzałek wskazują mutacje, które były identyczne z obserwowanymi w próbkach kału. Zgodnie z oczekiwaniami sekwencje szablonów pochodzących od nowotworów ujawniły jednoczesną obecność sekwencji typu dzikiego i zmutowanych. Przykłady podstawienia zasadniczego (w przypadku Pacjenta 11), delecji 5-bp (w przypadku Pacjenta 23) i wstawienia jednej podstawy (w przypadku Pacjenta 44) są zilustrowane
[podobne: psychozy endogenne, potencjał oksydoredukcyjny, charakteropatia objawy ]
[hasła pokrewne: dieta na kaloryfer, eskulap łomża, olx susz ]