Wykrywanie mutacji APC w kale DNA u pacjentów z guzami jelita grubego ad 5

Test skracania białek cyfrowych. Cyfrowe skracanie białka polega na amplifikacji niewielkiej liczby matryc genów APC w każdej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i wykryciu skróconych polipeptydów generowanych przez transkrypcję in vitro i translację produktów PCR. Termin cyfrowy jest używany do wskazania, że każda studzienka zawiera lub nie zawiera szablonów genów APC i że każdy test skracania białka jest zatem pozytywny (1) lub negatywny (0). Linie w każdym dużym kole reprezentują jednoniciowe szablony APC obecne w populacji DNA, z czarnymi i czerwonymi liniami wskazującymi odpowiednio na kopii typu dzikiego (normalne) i zmutowanych genów APC. W okręgu A zmutowane geny APC reprezentują dużą część całkowitych genów APC, jak można znaleźć w guzie lub w komórkach krwi pacjenta z rodzinną polipowatością gruczolakowatą. Analiza całej populacji cząsteczek za pomocą PCR oraz transkrypcji i translacji in vitro łatwo ujawnia zmutowany produkt, który jest równoważny intensywności do normalnego produktu APC (jak pokazano na ścieżce A schematycznego żelu po prawej stronie). W okręgu B zmutowane geny APC reprezentują tylko niewielką część całkowitych genów APC, co można znaleźć w kale pacjenta z rakiem jelita grubego. Analiza całej populacji cząsteczek za pomocą PCR oraz transkrypcji i translacji in vitro nie ujawnia zmutowanego produktu, ponieważ występuje on w zbyt małej proporcji cząsteczek, aby wytworzyć wykrywalny sygnał w teście (jak pokazano na ścieżce B żelu po prawej stronie). Aby zmniejszyć złożoność, a tym samym zwiększyć stosunek zmutowanych genów do normalnych genów, pobraliśmy od dwóch do czterech cząsteczek w każdej studzience, jak wskazują kółka oznaczone literami od C do G w okręgu B. Ścieżki D, F i G reprezentują studzienki bez zmutowane produkty; ścieżka C oznacza studzienkę, w której jeden z dwóch matryc APC był zmutowany; a ścieżka E oznacza studzienkę, w której zmutowano jeden z czterech wzorów APC. Liczba kopii genu APC na studzienkę zmienia się stochastycznie według rozkładu Poissona. Drugą przeszkodą techniczną było zidentyfikowanie mutacji w tych produktach PCR. Praktycznie wszystkie mutacje APC powodują powstawanie kodonów stop spowodowanych przez nonsensowne substytucje lub małe, poza ramką delecje lub insercje.41 Mutacje APC można zatem zidentyfikować poprzez transkrypcję in vitro i translację odpowiednio zmodyfikowanych produktów PCR .44,45 To in vitro . syntetyzowane białko lub skrócenie proteiny , test jest standardową metodą diagnostyki genetycznej rodzinnej polipowatości gruczolakowatej. Jednak nie można go wykorzystać do oceny próbek DNA kału, z uwagi na przewagę sekwencji typu dzikiego w takich próbkach. W szczególności czułość konwencjonalnego sposobu jest ograniczona do mutacji, które występują w więcej niż 15 procentach cząsteczek matrycowych, podczas gdy zmutowane geny APC były obecne w znacznie niższej częstotliwości w kałowym DNA (Figura 1). Dlatego opracowaliśmy modyfikację testu skracania białka, zwanego cyfrowym skróceniem białka, który znacznie zwiększył czułość (ryc. 1). Krótko mówiąc, do każdej reakcji włączono niewielką liczbę cząsteczek matrycowych, a produkty białkowe każdej reakcji rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.
[patrz też: homilopatia, afekt patologiczny, chlorowodorek fenylefryny ]
[więcej w: chlorowodorek fenylefryny, homilopatia, tasectan ulotka ]