Ekspresja p53 i rokowanie u dzieci z złośliwymi glejakami cd

Endogenna aktywność peroksydazy została zablokowana przez inkubację w 0,3% nadtlenku wodoru i metanolu. Skrawki ponownie uwodniono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Odzyskiwanie antygenu wzmocnionego mikrofalami37 przeprowadzono przez gotowanie szkiełek w 10 mM buforze cytrynianowym (pH 6,0). Niespecyficzne wiązanie przeciwciała blokowano przez inkubację z odczynnikiem blokującym białka (Immunon, Pittsburgh) przez 20 minut. Skrawki następnie inkubowano przez noc w 4 ° C z przeciwciałem anty-p53 (DO-7, Dako, Carpinteria, CA) w rozcieńczeniu 1: 300 we wspólnym rozcieńczalniku przeciwciał (BioGenex, San Ramon, CA). To przeciwciało rozpoznaje determinantę p53 typu dzikiego i zmutowanego w skrawkach utrwalonych w formalinie.38 Preparaty płukano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem znakowanym biotyną, a następnie koniugatem streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Związane przeciwciało ujawniono przy użyciu substratu 3,3 -diaminobenzydynę. 39 Skrawki wybarwiono kontrastowo hematoksyliną Mayera, przemyto, odwodniono za pomocą stopniowanych stężeń etanolu, oczyszczono w ksylenie, osadzono i zbadano mikroskopowo.
Do każdej partii sekcji włączono pozytywne i negatywne kontrole w celu potwierdzenia spójności analizy. Próbki badano niezależnie pod względem immunoreaktywności za pomocą przeciwciała przeciw histologicznie weryfikowalnemu antygenowi kontroli pozytywnej (tj. Barwieniu antygenu Ki-67 przez przeciwciało MIB1 [Immunotech, Westbrook, Me.] W postaciach mitotycznych w guzie), do zidentyfikować przypadki, w których brak immunoreaktywności dla p53 może wskazywać na problemy związane z zachowaniem tkanki, a nie na brak ekspresji białka. Takie przypadki zostały wyłączone z analizy wyniku.
Skrawki badano na immunoreaktywność p53 przez obserwatora, który był nieświadomy histologicznych diagnoz, wyników lub cech klinicznych. Tylko komórki o gęstym barwieniu jądrowym zostały zinterpretowane jako pozytywne. Nowotwory zostały skategoryzowane jako wyrażające niewielki lub brak p53 (stopień 0 lub 1), podobny do prawidłowego mózgu, lub jako nadeksprymujący p53, z barwieniem obserwowanym w sporej podgrupie komórek (25 do 50 procent, stopień 2), większość komórek ( 50 do 75 procent, stopień 3) lub prawie wszystkie komórki (> 75 procent, stopień 4) w polu dużej mocy w obszarach z maksymalnym zabarwieniem. Nadekspresję zdefiniowano zatem półilościowo, w oparciu o procent komórek wyrażających p53 w guzie.
Centralny Przegląd Patologiczny
Kryteria włączenia histopatologicznego do badania klinicznego CCG-945 opierały się wyłącznie na diagnozie patologicznej dokonanej w każdej instytucji, ale od tego czasu uznano, że klasyfikacja glejaków u dzieci jest niezwykle trudna i podlega różnym opiniom nawet wśród wykwalifikowanych recenzentów40. Aby wyeliminować możliwość, że wyniki w niniejszym badaniu mogą być pod wpływem zmian diagnostycznych wśród patologów w każdej instytucji, wszystkie próbki w bieżącym badaniu zostały w sposób zaślepiony zbadane przez starszego neuropatologa, aby zapewnić spójną klasyfikację w oparciu o współczesne wytyczne z Światowa Organizacja Zdrowia.9 Następnie zbadaliśmy związek nadmiernej ekspresji p53 i mutacji w TP53 z wynikiem, wykorzystując diagnozę dokonaną przez recenzenta w miejsce diagnozy postawionej w instytucji i wykluczając przypadki niezgodne (np. -poprawione glejaki) lub niejednoznaczne.
Analiza statystyczna
Do analizy wyniku nowotwory klasyfikowano zgodnie z obecnością lub brakiem nadmiernej ekspresji p53 lub mutacji w TP53
[podobne: pasemka caspariego`, afekt patologiczny, psychozy endogenne ]
[patrz też: eskulap lomza, psychozy endogenne, porencefalia ]